色譜法來檢測食品
色譜法是一種重要的分離分析方法，它是利用不同物質(zhì)在兩相中具有不同的分配系數(shù)(或吸附系數(shù)、滲透性)，當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些物質(zhì)在兩相中進(jìn)行多次反復(fù)分配而實(shí)現(xiàn)分離。在色譜技術(shù)中，流動(dòng)相為氣體的叫氣相色譜，流動(dòng)相為液體的叫液相色譜。固定相可以裝在柱內(nèi)，也可以做成薄層。前者叫柱色譜，后者叫薄層色譜。根據(jù)色譜法原理制成的儀器叫色譜儀，目前，主要有氣相色譜儀和液相色譜儀。
在這里主要介紹氣相色譜分析法。同時(shí)也適當(dāng)介紹液相色譜法。氣相色譜法的基本理論和定性定量方法也適用于液相色譜法。其不同之處在液相色譜法中介紹。典型的氣相色譜儀具有穩(wěn)定流量的載氣，將汽化的樣品由汽化室?guī)肷V柱，在色譜柱中不同組分得到分離，并先后從色譜柱中流出，經(jīng)過檢測器和記錄器，這些被分開的組分成為一個(gè)一個(gè)的色譜峰。色譜儀通常由下列五個(gè)部分組成：
載氣系統(tǒng)(包括氣源和流量的調(diào)節(jié)與測量元件等)
進(jìn)樣系統(tǒng)(包括進(jìn)樣裝置和汽化室兩部分)
分離系統(tǒng)(主要是色譜柱)
檢測、記錄系統(tǒng)(包括檢測器和記錄器)
輔助系統(tǒng)(包括溫控系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等)
載氣通常為氮、氫和氫氣，由高壓氣瓶供給。由高壓氣瓶出來的載氣需經(jīng)過裝有活性炭或分子篩的凈化器，以除去載氣中的水、氧等有害雜質(zhì)。由于載氣流速的變化會(huì)引起保留值和檢測靈敏度的變化，因此，一般采用穩(wěn)壓閥、穩(wěn)流閥或自動(dòng)流量控制裝置，以確保流量恒定。載氣氣路有單柱單氣路和雙柱雙氣路兩種。前者比較簡單，后者可以補(bǔ)償因固定液流失、溫度被動(dòng)所造成的影響，因而基線比較穩(wěn)定。
進(jìn)樣系統(tǒng)包括進(jìn)樣裝置和汽化室。氣體樣品可以用注射進(jìn)樣，也可以用定量閥進(jìn)樣。液體樣品用微量注射器進(jìn)樣。 固體樣品則要溶解后用微量注射器進(jìn)樣。樣品進(jìn)入汽化室后在一瞬間就被汽化，然后隨載氣進(jìn)入色譜柱。根據(jù)分析樣品的不同，汽化室溫度可以在50—400℃范圍內(nèi)任意設(shè)定。 通常，汽化室的溫度要比使用的zui高柱溫高10—50℃以保證樣品全部汽化。進(jìn)洋量和進(jìn)樣速度會(huì)影響色譜柱效率。進(jìn)樣量過大造成色譜柱超負(fù)荷，進(jìn)樣速度慢會(huì)使色譜峰加寬，影響分離效果。
試樣中各組分的分離在色譜柱中進(jìn)行，因此，色譜柱是色譜儀的核心部分。色譜往主要有兩類：填充柱和毛細(xì)管柱，現(xiàn)分別敘述如下:
1、填充柱 :填充柱由柱管和固定相組成，柱管材料為不銹鋼或玻璃，內(nèi)徑為2—4毫米，長為1—3米。往內(nèi)裝有固定相，固定相又包括固體固定相和液體固定相兩種。
2、毛細(xì)管往 :毛細(xì)管柱又叫空心柱，空心柱分涂壁空心柱，多孔層空心柱和涂載體空心柱。涂壁空心柱是將固定液均勻地涂在內(nèi)徑0.1—0.5毫米的毛鋼管內(nèi)壁而成。毛細(xì)管的材料可以是不銹鋼、玻璃或石英。這種色譜柱具有滲透性好、傳質(zhì)阻力小等特點(diǎn)，因此柱子可以做得很長(一般幾十米，zui長可到三百米)。和填充柱相比，其分離效率高，分析速度快,樣品用量小。其缺點(diǎn)是樣品負(fù)荷量小，因此經(jīng)常需要采用分流技術(shù)。柱的制備方法也比較復(fù)雜;多孔層空心柱是在毛細(xì)管內(nèi)壁適當(dāng)沉積上一層多孔性物質(zhì)，然后涂上固定液。這種柱容量比較大，滲透性好，故有穩(wěn)定、高效、決速等優(yōu)點(diǎn)。
1、氫火焰離子化檢測器：氫火焰離子化檢測器(Flame Ionization Detector，F(xiàn)ID)簡稱氫焰檢測器。它的主要部件是一個(gè)用不銹鋼制成的離子室。離子室由收集極、極化極(發(fā)射極)、氣體入口及火焰噴嘴組成。在離子室下部，氫氣與載氣混合后通過噴嘴，再與空氣混合點(diǎn)火燃燒，形成氫火焰。無樣品時(shí)兩極間離子很少，當(dāng)有機(jī)物進(jìn)入火焰時(shí)，發(fā)生離子化反應(yīng)，生成許多離子。在火焰上方收集極和極化極所形成的靜電場作用下，離子流向收集極形成離子流。離子流經(jīng)放大、記錄即得色譜峰。
有機(jī)物在氫火焰中離子化反應(yīng)的過程如下：當(dāng)氫和空氣燃燒時(shí)，進(jìn)入火焰的有機(jī)物發(fā)生高溫裂解和氧化反應(yīng)生成自由基，自由基又與氧作用產(chǎn)生離子。在外加電壓作用下，這些離子形成離子流，經(jīng)放大后被記錄下來。所產(chǎn)生的離子數(shù)與單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入火焰的碳原子質(zhì)量有關(guān)，因此，氫焰檢測器是一種質(zhì)量型檢測器。這種檢測器對(duì)絕大多數(shù)有機(jī)物都有響應(yīng)，其靈敏度比熱導(dǎo)檢測器要高幾個(gè)數(shù)量級(jí)，易進(jìn)行痕量有機(jī)物分析。其缺點(diǎn)是不能檢測惰性氣體、空氣、水、C0，CO2,NO、S02等。
2、熱導(dǎo)檢測器熱導(dǎo)檢測器(Thermal coductivity detector，簡稱TCD )：是應(yīng)用比較多的檢測器，不論對(duì)有機(jī)物還是無機(jī)氣體都有響應(yīng)。熱導(dǎo)檢測器由熱導(dǎo)池池體和熱敏元件組成。熱敏元件是兩根電阻值*相同的金屬絲(鎢絲或白金絲)，作為兩個(gè)臂接入惠斯頓電橋中，由恒定的電流加熱。如果熱導(dǎo)池只有載氣通過，載氣從兩個(gè)熱敏元件帶走的熱量相同，兩個(gè)熱敏元件的溫度變化是相同的，其電阻值變化也相同，電橋處于平衡狀態(tài)。如果樣品混在載氣中通過測量池，由于樣號(hào)氣和載氣協(xié)熱導(dǎo)系數(shù)不同，兩邊帶走的熱量不相等，熱敏元件的溫度和阻值也就不同，從而使得電橋失去平衡，記錄器上就有信號(hào)產(chǎn)生。這種檢測器是一種通用型檢測器。被測物質(zhì)與載氣的熱導(dǎo)系數(shù)相差愈大，靈敏度也就愈高。此外，載氣流量和熱絲溫度對(duì)靈敏度也有較大的影響。熱絲工作電流增加—倍可使靈敏度提高3—7倍，但是熱絲電流過高會(huì)造成基線不穩(wěn)和縮短熱絲的壽命。熱導(dǎo)檢測器結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定性好，對(duì)有機(jī)物和無機(jī)氣體都能進(jìn)行分析，其缺點(diǎn)是靈敏度低。
3、電子捕獲檢測器：電子捕獲檢測器是一種選擇性很強(qiáng)的檢測器，它只對(duì)合有電負(fù)性元素的組分產(chǎn)生響應(yīng)，因此，這種檢測器適于分析合有鹵素、硫、磷、氮、氧等元素的物質(zhì)。在電子捕獲檢測器內(nèi)一端有一個(gè)多放射源作為負(fù)極，另一端有一正極。兩極間加適當(dāng)電壓。當(dāng)載氣(N2)進(jìn)入檢測器時(shí)，受多射線的輻照發(fā)生電離，生成的正離子和電子分別向負(fù)極和正極移動(dòng)，形成恒定的基流。合有電負(fù)性元素的樣品AB進(jìn)入檢測器后，就會(huì)捕獲電子而生成穩(wěn)定的負(fù)離子，生成的負(fù)離子又與載氣正離子復(fù)合。結(jié)果導(dǎo)致基流下降。因此，樣品經(jīng)過檢測器，會(huì)產(chǎn)生一系列的倒峰。電子捕獲檢測器是常用的檢測器之一，其靈敏度高，選擇性好。主要缺點(diǎn)是線性范圍較窄。
氣相色譜法是一種很好的分離、分析方法，它具有分析速度快、分離效能好和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。但是氣相色譜僅能分析在操作溫度下能汽化而不分解的物質(zhì)。據(jù)估計(jì)，在已知化合物中能直接進(jìn)行氣相色譜分析的化合物約占15%，加上制成衍生物的化合物，也不過20%左右。對(duì)于高沸點(diǎn)化合物;難揮發(fā)及熱不穩(wěn)定的化合物、離子型化合物及高聚物等，很難用氣相色譜法分析。為解決這個(gè)問題，70年代初發(fā)展了高效液相色譜。高效液相色譜的原理與經(jīng)典液相色譜相同，但是它采用了高效色譜拄、高壓泵和高靈敏度檢測器。因此，高效液相色譜的分離效率、分析速度和靈敏度大大提高。就其分離機(jī)理的不同，高效液相色譜可以分為液—固吸附色譜、液—液分配色譜、離子交換色譜和凝膠滲透色譜四類。
高效液相色譜的檢測器很多，zui常用的有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器等。
(1)、示差折光檢測器：示差折光檢測器是根據(jù)不同物質(zhì)具有不同折射率來進(jìn)行組分檢測的。凡是具有與流動(dòng) 相折射率不同的組分，均可以使用這種 檢測器。如果流動(dòng)相選擇適當(dāng)，可以檢測所有的樣品組分。示差折光檢測器分為反射式和沂射式兩種。反射式示差折光檢測器是根據(jù)下述原理制成的：光在兩種不同物質(zhì)界面的反射百分率與入射角和兩種物質(zhì)的折射率成正比。如果入射角固定，光線反射百分率僅與這兩種物質(zhì)的沂射率成正比。光通過僅有流動(dòng)相的參比池時(shí)，由于流動(dòng)相組成不變，故其折射率是固定的;光通過工作池時(shí)，由于存在待測組分而使折射串改變，從而引起光強(qiáng)度的變化，測量光強(qiáng)度的變化，即可測出該組分濃度的變化。偏轉(zhuǎn)式示差折光檢測器是根據(jù)下述原理：當(dāng)一束光透過折射率不同的兩種物質(zhì)時(shí)，此光束會(huì)發(fā)生一定程度的偏轉(zhuǎn)，其偏轉(zhuǎn)程度正比于兩物質(zhì)折射率之差。示差折光檢測器的優(yōu)點(diǎn)是通用性強(qiáng)，操作簡便;缺點(diǎn)是靈敏度低，不能做痕量分析。此外，由于洗脫液組成的變化會(huì)使折射率變化很大，因此，這種檢測器也不適用于梯度洗脫。
(2)、紫外檢測器：紫外檢測器是液相色譜中應(yīng)用zui廣泛的檢測器，適用有紫外吸收物質(zhì)的檢測。在進(jìn)行高效液相色譜分析的樣品中，約有80%的樣品可以使用這種檢測器。紫外檢測器的工作原理如下：由光源產(chǎn)生波長連續(xù)可調(diào)的紫外光或可見光， 經(jīng)過透鏡和遮光板變成兩束平行光，無樣品通過時(shí)，參比池和樣品池通過的光強(qiáng)度相等，光電管輸出相同，無信號(hào)產(chǎn)生;有樣品通過時(shí)，由于樣品對(duì)光的吸收，參比池和樣品池通過的光強(qiáng)度不相等，有信號(hào)產(chǎn)生。根據(jù)朗伯—比爾定律，樣品濃度越大，產(chǎn)生的信號(hào)越大，這種檢測器靈敏度高，檢測下限約為10-10g/ml，而且線性范圍廣，對(duì)溫度和流速不敏感，適于進(jìn)行梯度洗脫。
(3)、熒光檢測器：物質(zhì)的分子或原子經(jīng)光照射后，有些電子被激發(fā)至較高的能級(jí)，這些電子從高能級(jí) 躍至低能級(jí)時(shí)，物質(zhì)會(huì)發(fā)出比入射光波長較 長的光，這種光稱為熒光。在其他條件一定的情況下，熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比。許多有機(jī)化合物具有天然熒光活性，另外，有些化合物可以利用柱后反應(yīng)法或柱前反應(yīng)法加入熒光化試劑，使其轉(zhuǎn)化為具有熒光活性的衍生物。在紫外光激發(fā)下，熒光活性物質(zhì)產(chǎn)生熒光，由光電倍增管轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。熒光檢測器是一種選擇性檢測器，它適合于稠環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素、蛋白質(zhì)等熒光物質(zhì)的測定。這種檢測器靈敏度非常高，比紫外檢測器高2—3個(gè)數(shù)量級(jí)，適合于痕量分析。而且可以用于梯度洗脫。其缺點(diǎn)是適用范圍有一定的局限性。
液—固色譜的色譜柱內(nèi)填充固體吸附劑，由于不同組分具有不同的吸附能力，因此，流動(dòng)相帶著被測組分經(jīng)過色譜柱時(shí)，各組分被分開。液—液色譜的流動(dòng)相和固定相都是液體。作為固定相的液體涂在惰性擔(dān)體上，流動(dòng) 相與固定液不互溶。當(dāng)帶有被測組分的流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱時(shí)，組分在兩相間很快達(dá)分配平衡，由于各組分在兩相間分配系數(shù)不同而彼此分離。以非極性溶液作流動(dòng)相，極性物質(zhì)作固定相的液—液色譜叫正相色譜;極性溶液作流動(dòng)相，非極性物質(zhì)作固定相的液—液色譜叫反相色譜。離子交換色譜的色譜柱內(nèi)填充離子交換樹脂，依靠樣品離子交換能力的差別實(shí)現(xiàn)分離。而凝膠色譜是按試樣中分子大小的不同來進(jìn)行分離的。在上述四類色譜中，應(yīng)用zui廣泛的是液—液色譜，因此，在本節(jié)的討論中以液—液色譜為主。高效液相色譜的基本理論和定性定量分析方法與氣相色譜基本相同。高效液相色譜儀由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。
高效液相色譜的輸液系統(tǒng)包括流動(dòng)相貯存器、高壓泵和梯度淋洗裝置。流動(dòng)相貯存器為不銹鋼或玻璃制成的容器，可以貯存不同的流動(dòng)相。高壓泵是高效液相色譜儀zui重要的部件之一。由于高效液相色譜儀所用色譜柱直徑細(xì)，固定相粒度小，流動(dòng)相阻力大，因此，必須借助于高壓泵使流動(dòng)相以較快的速度流過色譜這。高壓泵需要滿足以下條件：能提供150—450kg/cm2的壓強(qiáng);流速穩(wěn)定，流量可以調(diào)節(jié);耐腐蝕。目前所用的高壓泵有機(jī)械泵和氣動(dòng)放大泵兩種。梯度淋洗裝置可以將兩種或兩種以上的不同極性溶劑，按一定程序連續(xù)改變組成，以達(dá)到提高分離效果，縮短分離時(shí)間的目的。它的作用與氣相色譜中的程序升溫裝置類似。
梯度淋洗裝置分為兩類：一類叫外梯度裝置;一類內(nèi)梯度裝置。外梯度裝置是流動(dòng)相在常壓下混合，靠一臺(tái)高壓泵壓至色譜柱;內(nèi)梯度裝置是先將溶劑分別增壓后，再由泵按程序壓入混合室，再注入色譜柱。一般高效液相色譜多采用六通閥進(jìn)樣。先由注射器將樣品常壓下注入樣品環(huán)。然后切換閥門到進(jìn)樣位置，由高壓泵輸送的流動(dòng)相將樣品送人色譜柱。樣品環(huán)的容積是固定的，因此進(jìn)樣重復(fù)性好。
分離系統(tǒng)包括色譜柱、連接管、恒溫器等。色譜柱是高效液相色譜儀的心臟。它是由內(nèi)部拋光的不銹鋼管制成，一般長10—50cm，內(nèi)徑2—5mm，柱內(nèi)裝有固定相。液相色譜的固定相是將固定該涂在擔(dān)體上而成。擔(dān)體有兩類：一類是表面多孔型擔(dān)體;另一類是全多孔型擔(dān)體。
近年來又出現(xiàn)了全多孔型微粒擔(dān)體。這種擔(dān)體檢度為5—10um，是由nm級(jí)的硅膠微粒堆積而成，又叫堆積硅珠。由于顆粒小，所以柱效高，是目前zui廣泛使用的一種擔(dān)體。在高效液相色譜分析中，適當(dāng)提高柱溫可改善傳質(zhì)，提高桂效，縮短分析時(shí)間。因此，在分析時(shí)可以采用帶有恒溫加熱系統(tǒng)的金屬夾套來保持色譜拄的溫度。溫度可以在室溫到60℃間調(diào)節(jié)。
質(zhì)-質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜—質(zhì)譜聯(lián)用 80年代初，在傳統(tǒng)的質(zhì)譜儀基礎(chǔ)上，發(fā)展了質(zhì)譜—質(zhì)語(MS—MS)聯(lián)用技術(shù)。它和GC—MS不同，GC—MS是依靠GC將混合物分離，然后由MS定性。而MS—MS則是依靠第-一級(jí)MS分離出特定的離子，經(jīng)過碰撞活化后，再依靠第二級(jí)MS進(jìn)行定性分析。質(zhì)譜—質(zhì)譜聯(lián)用方式很多，既有磁式質(zhì)譜—質(zhì)譜聯(lián)用，如BEB型、EBE型、BEBE型(B：磁分析器，E：靜電分析器)，又有四極質(zhì)譜—質(zhì)譜聯(lián)用。無論哪種類型的聯(lián)用，都采用了碰撞誘導(dǎo)分解(CID)技術(shù)。 質(zhì)譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)于有機(jī)物結(jié)構(gòu)研究是非常有用的。利用它可以進(jìn)行于離子掃描、母離子掃描以及中性丟失掃描。子離子掃描可以用來研究某個(gè) 化合物的結(jié)構(gòu);母離子掃描則用以研究一組相關(guān)的化合物;而中性丟失掃描?？梢栽趶?fù)雜的混合物中，尋找現(xiàn)有相同官能團(tuán)的系列化合物。同時(shí)，采用MS—MS技術(shù)還可以直接進(jìn)行混合有機(jī)物的分析。由第-一級(jí)MS選擇復(fù)雜 混合物中的特定離子，碰撞活化后由第二級(jí)MS定性測定。另外，對(duì)于分子量大的熱不穩(wěn)定的化合物，可以利用場解吸—質(zhì)譜—質(zhì)譜(FD—MS—MS)或快原于轟擊—質(zhì)譜—質(zhì)譜(FAB—MS—MS)聯(lián)用方法，充分發(fā)揮MS—MS聯(lián)用的優(yōu)勢(shì)
離子色譜法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)測定溶液中陰離子和陽離子的一種分析方法。離子色譜是液相色譜的一種。離子色譜是利用不同離子對(duì)固定相親合力的差別來實(shí)現(xiàn)分離的。離子色譜的固定相是離子交換樹脂，離子交換樹脂是苯乙烯—二乙烯基苯的共聚物。樹脂核外是一層可離解的無機(jī)基團(tuán)，由于可離解基團(tuán)的不同，離子交換樹脂又分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。當(dāng)流動(dòng)相將樣品帶到分離柱時(shí)，由于樣品離子對(duì)離子交換樹脂的相對(duì)親合能力不同而得到分離，由分離柱流出的各種不同離子，經(jīng)檢測器檢測，即可得到一個(gè)個(gè)色譜峰。然后用通常的色譜定性定量方法進(jìn)行定性定量分析.
離子色譜法是進(jìn)行離子測定的快速、靈敏、選擇性好的方法，它可以同時(shí)檢測多種離子，特別是對(duì)陰離子的測定更是其他方法所不能相比的。如果說高頻感應(yīng)等離子光譜是同時(shí)測定多種元素的快速、準(zhǔn)確的分析方法，那么，同時(shí)測定多種陰離子的快速、靈敏的方法便是離子色譜法了。
離子色譜自1975年問世以來，已經(jīng)得到了飛快的發(fā)展，并且引起了分析工作者的廣泛注意。目前，離子色譜法已經(jīng)在能源、環(huán)境、冶金、電鍍、半導(dǎo)體、水文地質(zhì)等方面廣泛應(yīng)用，并且開始進(jìn)入了與生命科學(xué)有關(guān)的分析領(lǐng)域。我國從80年代初期引進(jìn)離子色譜儀，開始了離子色譜的應(yīng)用研究工作，同時(shí)也開始了儀器的研制，目前已能生物試劑離子色譜儀。隨著離子色譜技術(shù)的發(fā)展，離于色譜儀在我國的應(yīng)用將日益普及。
(1)、化學(xué)抑制型離子色譜工作原理 待測樣品由流動(dòng)相帶入分離柱，由分離柱將不同離子分開，由檢測器得色譜峰。但是，用于離子色譜的洗脫液，一般都是強(qiáng)電解質(zhì)溶液，其電導(dǎo)值一般較待測離子高2—3個(gè)數(shù)量級(jí)，如果用電導(dǎo)檢測器檢測待測離子，待測離子信號(hào)將*被洗脫液所淹沒。為了解決這一問題，采取色譜法是有機(jī)物的有效分離分析方法，特別適用于進(jìn)行有機(jī)物的定量分析，但定性分析比 較困難。質(zhì)譜法擅長定性分析，但對(duì)復(fù)雜的有機(jī)混合物分析則無能為力。如果把二者結(jié)合起來，則能發(fā)揮兩種儀器各自的優(yōu)點(diǎn)。因此，目前所有的質(zhì)譜儀都與氣相色譜相連。組成氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(GC—MS)系統(tǒng)。
(2）、離子交換平衡 離子色譜中使用的固定相是離子交換樹脂。離子交換樹脂上分布有固定的帶電荷的基團(tuán)和能游動(dòng)的配位離子。當(dāng)樣品加入離子交換色譜往后，如果用適當(dāng)?shù)娜芤合疵?，樣品離子即與樹脂上能游動(dòng)的離子進(jìn)行交換，并且連續(xù)進(jìn)行可逆交換吸附和解吸，zui后達(dá)到吸附平衡。
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